روش های جذبی برای تعیین غلظت DNA

متداول ترین روش برای تعیین عملکرد و خلوص DNA اندازه گیری میزان جذب است. اندازه گیری جذب ساده است و به تجهیزات آزمایشگاهی متداول نیاز دارد. تمام آنچه برای روش جذب لازم است یک اسپکتروفتومتر است که مجهز به یک لامپ UV و محلول DNA خالص است. خوانش جذب در 260 نانومتر (A260) انجام می شود که در آن DNA به شدت جذب می شود و  به فرد امکان آگاهی از غلظت محلول را می دهد. برای اطمینان از کاربردی بودن اعداد، خوانش A260 باید در محدوده خطی ساز (عموماً 1.0-0.1) باشد.

تعیین غلظت DNA

غلظت DNA با معادله زیر محاسبه می شود. برای تنظیم اندازه گیری A260 از جهت کدورت، از اندازه گیری جذب در 320nm استفاده می شود. در این معادله از ضریب رقیق سازی نیز استفاده می شود.

غلظت (میکروگرم/میلی لیتر) = (خوانش A260 – خوانش A320) * ضریب رقیق سازی * 50 میکروگرم/میلی لیتر

نتیجه نهایی با ضرب غلظت DNA توسط حجم نمونه خالص نهایی به دست می آید.

نتیجه نهایی یا غلظت نهایی DNA (میکروگرم) = غلظت DNA * حجم کل نمونه (میلی لیتر)

با این حال، DNA تنها مولکولی نیست که می تواند نور UV را در 260 نانومتر جذب کند. از آنجا که RNA همچنین دارای جذب بسیار خوبی در 260 نانومتر است، اسیدهای آمینه معطر موجود در پروتئین نیز در 280 نانومتر جذب می شوند. هر دو آلاینده در صورت وجود در محلول DNA، در اندازه گیری کل در 260 نانومتر نقش دارند. علاوه بر این، وجود گوانیدین (guanidine) منجر به جذب بالاتر از 260 نانومتر خواهد شد. این بدان معنی است که اگر از عدد A260 برای محاسبه غلظت نهایی استفاده شود، مقدار DNA ممکن است بیش از حد تخمین زده شود.

تعیین خلوص DNA

برای ارزیابی خلوص DNA، میزان جذب از 230nm تا 320nm را برای شناسایی سایر آلاینده های احتمالی اندازه گیری کنید. رایج ترین محاسبه خلوص، اندازه گیری نسبت جذب در 260 نانومتر است که به عدد جذب در 280 نانومتر تقسیم می شود. DNA با کیفیت خوب نسبت A260 / A280 در محدوده 2.0-1.7 خواهد داشت. با این وجود عدد 1.6 به معنای نامناسب بودن DNA برای هر کاربردی نیست اما عددهای پایین تر از آن نشان دهنده آلاینده های بیشتری است. این نسبت را می توان بعد از تصحیح کدورت (جذب در 320nm) محاسبه کرد.

خلوص دی ان ای A260/A280 = (خوانش A260 – خوانش A320) ÷ (خوانش A280 – خوانش A320)

جذب قوی در حدود 230 نانومتر می تواند نشان دهد که ترکیبات آلی یا نمکهای آشوبزا در DNA خالص وجود دارد. نسبت 260 نانومتر به 230 نانومتر می تواند به ارزیابی میزان انتقال نمک در DNA خالص کمک کند. هر چه این نسبت پایین تر باشد، به عنوان مثال مقدار نمک تیوسیانات بیشتر است. به عنوان یک راهنما، A260/A230 اگر بیشتر از 1.5 باشد بهتر است. خوانش در 320nm نشان می دهد که آیا کدورت در محلول وجود دارد که یکی دیگر از نشانه های آلودگی احتمالی است. بنابراین ، خوانش جذب در بازه طول موجی از 230nm تا 320nm بسیار مفید است.

اسپکتروفتومتر و بیولوژی